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基于技术研究八角枫对大鼠血浆与尿液代谢的影

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关键词:

摘要：

中药八角枫来自八角枫科八角枫属植物八角枫的根，别名八角将军、大风药等[1]。它是传统麻醉技术中的肌松剂，现多用于治疗风湿疼痛，麻木瘫痪，心力衰竭，劳伤腰痛，跌打损伤等症[2-3]。八角枫长时间使用其治疗量与中毒量十分接近，若不合理使用可能发生中毒甚至出现死亡[4-5]。八角枫长期使用后会引起机体在代谢方面的变化，这种变化可用于药物安全分析。近年来代谢组学被广泛应用于临床毒理学和药物安全研究[6]。为了更全面地探讨八角枫不同剂量对大鼠代谢途径的影响，笔者使用气相色谱-质谱法（GC-MS）研究了八角枫提取物对大鼠的尿液与血浆代谢谱的影响。

1 材料与方法

1.1 实验动物雄性 SD 大鼠 32 只，体质量（200±20）g，购自上海斯莱克实验动物有限公司，动物合格证号：Wydw 2013-0071。饲养于温州医科大学实验动物研究中心，温度22 ℃，相对湿度70%，昼夜循环12 h/12 h，自由进食及饮水。

1.2 主要仪器与试剂Agilent 6890N-5975B GC-MS 和HP-5 MS（0.25 mm×30 m，0.25 μm）购自美国安捷伦公司。三甲基氯硅烷（TMCS）、N-甲基-N-（三甲基甲硅烷基）三氟乙酰胺（MSTFA）、甲基羟基胺盐酸盐和吡啶（纯度＞98%）购自美国西格玛奥德里奇公司；HPLC 级乙腈和正庚烷购自美国天地公司；八角枫原料来自温州医科大学附属第一医院，在常压条件下，于100 ℃水煎30 min，丢弃残渣，得八角枫煎煮液。

1.3 动物分组及给药方法将大鼠随机分为对照组及八角枫低、中、高剂量组，每组8 只。对照组按1.00 mL（/kg·d）的剂量灌胃生理盐水；八角枫低、中、高剂量组分别按0.25、0.50、1.00 g（/kg·d）的剂量灌胃八角枫煎煮液，共14 d。于第15 天清晨收集大鼠血浆标本和尿液标本，-80 ℃下保存待测。

1.4 样品制备将300 μL 乙腈加入到100 μL 血浆或尿液中，涡旋1 min，再于4 ℃条件下10 000×g离心10 min。将上清液250 μL 转移至离心管中，于真空冷冻干燥器中蒸干24 h。加入50 μL 甲基羟胺盐酸盐（以浓度为15 mg/mL 的吡啶溶液作为溶剂）后，在 70 ℃下甲肟化 24 h。加入 50 μL MSTFA（含 1%TMCS 作为催化剂）保持在 70 ℃ 1 h，加入150 μL 正庚烷，离心后取上清液100 μL 于进样瓶的内插管，待测。

1.5 统计学方法将GC-MS 数据导出到Microsoft Excel 中，在多变量分析之前将峰标准化为光谱的总和。使用软件通过主成分分析（PCA）和偏最小二乘法判别分析（PLS-DA）处理得到的数据。用SPSS18.0 软件分析实验数据，数据资料以（）表示，采用t检验。以P＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 各组大鼠血浆与尿液PLS-DA、偏最小二乘回归3D 模型（PLS-3D）评分比较见图1。各组间PLS-DA 评分分离效果不佳，各组间互相有交叉，但血浆的分离效果要好于尿液样本。见图2。八角枫各剂量组与对照组PLS-3D 评分可以区分。且PLS-3D 评分结果较PLS-DA 评分结果好，随着剂量的增加，在PLS-3D 评分上有不同程度偏移。血浆的结果比尿液的结果好，可能是因为血浆样品比尿液药品更稳定。

图1 各组大鼠血浆与尿液PLS-DA 评分比较

图2 各组大鼠血浆与尿液PLS-3D 评分比较

2.2 各组大鼠血浆及尿液代谢物相对含量比较见表1。与对照组比较，八角枫高剂量组血浆尿素相对含量升高（P＜0.05），八角枫中、高剂量组血浆葡萄糖、黄胺酸和琥珀酰胺酸相对含量降低（P＜0.05）。见表2。与对照组比较，八角枫低剂量组尿液中木糖醇相对含量升高（P＜0.05），八角枫高剂量尿液戊二酸相对含量降低（P＜0.05）。

3 讨论

八角枫是一种落叶灌木或乔木，为蜜源植物，广泛分布于我国，特别是在南方地区[7-8]。八角枫主要成分为生物碱，其中毒黎碱作为一种肌松药，配合强化麻醉、中麻、针麻应用于各种外科手术，取得良好效果[9-10]。通常毒黎碱于1～2 min 即可显示对骨骼肌的作用，开始出现轻度肌肉现象，而于3～5 min 后开始松弛，四肢肌肉、头颈部先松弛，呼吸肌最后受影响。现代药理研究表明，八角枫具有镇痛、抗炎、抗风湿、肌肉松弛等作用[11-12]。可见其药理活性广泛、低毒高效，其在肿瘤疾病、肌肉松弛、消炎镇痛及抗风湿等方面有一定的治疗效果，故有良好的应用价值和开发前景[13-15]。

目前，体液中多种生物碱检测方法主要有液相色谱法（HPLC）、GC-MS 及液相色谱-质谱法（LC-MS、LC-MS/MS）等[16-17]。其中GC-MS 在多反应监测模式下可提高信噪比，降低背景噪音，从而提高选择性和灵敏度，且受基质效应影响较小，能够用于体液中生物碱的检测。代谢组学作为内源性生物标志鉴定的一种重要方法，已被广泛应用于中药药理与中药毒理的研究[18-20]。本研究PLS-3D 评分图显示，八角枫各剂量组与对照组均可区分，随着剂量的增加，在PLS-3D 上的位置也有不同程度的偏移。与对照组比较，八角枫高剂量组大鼠血浆中尿素升高，八角枫中、高剂量组大鼠血浆葡萄糖、黄胺酸和琥珀酰胺酸降低；八角枫低剂量组大鼠尿液中木糖醇升高，而八角枫高剂量组大鼠尿液中戊二酸降低。提示八角枫能导致大鼠血浆与尿液代谢紊乱，此可为八角枫长期使用引起的机体毒理学变化、安全用药等提供参考。

文章来源：《生态毒理学报》网址: http://www.stdlxbzz.cn/qikandaodu/2021/0309/668.html