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布鲁菌液体气溶胶肺部感染途径小鼠模型建立及

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关键词:

摘要：

布鲁菌是一种可以导致人兽共患传染病——布鲁菌病（简称布病）的革兰阴性胞内寄生菌[1-2]，根据宿主的不同分为10个种，其中以牛、羊、猪种感染发病最常见[3]。其感染途径多样，主要包括呼吸道、消化道和皮肤接触，其中以气溶胶形式经呼吸道感染为最常见的感染途径之一[4]。

布鲁菌感染动物能致其流产、不育，给畜牧业造成严重的经济损失；感染人能引起神经系统、骨骼肌系统、肝胆系统、心血管系统、泌尿系统等全身各系统病变、出现发热、盗汗、乏力等全身不适症状[1， 5-6]。目前认为，主动免疫是预防布病的有效方法[7]，疫苗的使用显著降低了动物布病的发生，但很多疫苗有干扰血清学诊断和使动物致病的弊端[8]，因此克服这些弊端，研发安全有效的疫苗，是人们努力的方向。近年来，人们对于布鲁菌的毒理因子、免疫逃逸机制和免疫分子机制做了大量研究，越来越多的研究认为，布鲁菌是胞内寄生菌，免疫接种后，血清抗体水平下降至较低水平时，依然能发挥抗感染保护作用，说明布鲁菌免疫效力以细胞免疫为主[9]。布鲁菌主要寄生在宿主的巨噬细胞、胎盘滋养层细胞和树突状细胞[10]，由于巨噬细胞有更多的布鲁菌模式识别受体，因此，布鲁菌优先感染巨噬细胞[11]，在巨噬细胞内抑制TNF-α的分泌，从而抑制巨噬细胞的凋亡，同时使吞噬细胞的吞噬杀伤功能减退，布鲁菌在细胞内与溶酶体融合，形成布氏小体，逃逸监视，在胞内为自己创造了良好的居住环境，逃逸机体的免疫应答和免疫杀伤作用，从而在胞内生存繁殖，导致机体持续慢性感染[12]。

本研究以BALB/c小鼠为研究对象，构建布鲁菌液体气溶胶感染小鼠模型，以脾肿大、脾肺载菌量检测感染小鼠的毒理反应，以血清抗体和细胞因子的消长变化等指标来评价布鲁菌液体气溶胶感染小鼠免疫反应，为进一步研究气溶胶感染机制和对寻找有效的控制气溶胶感染措施提供实验基础。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 实验动物与菌株来源选取6～8周龄无特定病原体（SPF级）BALB/c雌性小鼠[北京维通利华实验动物技术有限公司，许可证号SCXK（京）2016-0011]，体质量18～20 g。牛种布鲁菌疫苗株A19购自新疆天牧公司，经过小鼠的传代复壮，2周后用布氏选择性培养基从小鼠体内分菌，经实验室鉴定保种命名为S19-CN。

1.1.2 主要试剂与仪器 BBLTMBrucella Agar、BBLTMBrucella Broth、TSA Tryptic Soy Agar和TSB Tryptic Soy Broth培养基均购自美国BD公司；Brucella selective supplement购自英国OXOID公司；ELISA试剂盒购自深圳达科为生物技术有限公司；细胞因子检测试剂盒购自美国e Bioscience公司。小动物喉镜购自北京慧荣和科技有限公司；手持式气管插管液体气溶胶肺递送装置购自北京慧荣和科技有限公司。

1.2 实验方法

1.2.1 菌液制备取20 μl布鲁菌S19-CN接种于20 ml的Brucella Broth中，于37 ℃摇床200 rpm振荡培养约18 h至对数中期（O.D.600 nm≈1.0），20倍稀释转接于20 ml的Brucella Broth中，继续振荡培养约12 h至对数中期，离心集菌，用含0.05%泊洛沙姆188的生理盐水洗菌2次后再次重悬，调O.D.600 nm使得菌浓度约为5×109CFU/ml用于后期小鼠感染模型建立。另取少量菌液进行梯度稀释后涂板计数，计算实际菌浓度。

1.2.2 感染模型建立实验分4组：肺递送实验组Z1（肺递送接种布鲁菌S19-CN）；肺递送空白对照组Z2（肺递送接种仅含体积比为0.05%泊洛沙姆188的生理盐水）；滴鼻实验组Z3（滴鼻接种布鲁菌S19-CN）；滴鼻空白对照组Z4（滴鼻接种仅含体积比为0.05%泊洛沙姆188的生理盐水）。将所有BALB/c小鼠腹腔注射1%戊巴比妥麻醉，3 min后小鼠夹捏背部皮肤无反应，说明小鼠麻醉状态良好，可用于后续实验。将制备好菌液（浓度约为5×109CFU/ml）分成2份，1份10 ml直接用于滴鼻，每只小鼠20 μl；空白对照滴鼻组给予20 μl 含0.05%泊洛沙姆188的生理盐水；1份4 ml菌液加入6 ml生理盐水，用于肺递送，每只小鼠50 μl。空白对照肺递送组给予每只小鼠50 μl含0.05%泊洛沙姆188的生理盐水。肺递送组：用镊子夹住小鼠舌头，向口外牵拉，打开喉镜，顺小鼠口咽方向探伸，可见到随呼吸一张一合的会厌，在会厌张开时，用备好的手持式气溶胶肺递送装置深入咽喉到达气管，并快速推进一个卡扣（50 μl）量程。肺递送实验组递送的是50 μl制备好的菌液，肺递送空白对照组递送的是50 μl菌体悬液，即仅含体积比0.05%泊洛沙姆188的生理盐水。滴鼻组：用20 μl的移液枪，吸取菌液（使用前再次混匀），左手抓住小鼠背部，翻转，使小鼠腹侧朝上，头高位倾斜，直接缓慢滴入小鼠鼻孔内，滴速不宜过快，以免引起小鼠呛咳反应或窒息而死，滴鼻实验组滴入的是20 μl制备好的菌液，空白对照滴鼻组滴入的是20 μl菌体悬液，即仅含体积比0.05%泊洛沙姆188的生理盐水。小鼠接种完毕，头高位放置，以免菌液通过小鼠鼻腔气管倒流，保证接种剂量的准确。接种后约3 h小鼠苏醒，未见死亡。实验过程中给予小鼠充足的食物和水，每天12 h光照。

文章来源：《生态毒理学报》网址: http://www.stdlxbzz.cn/qikandaodu/2021/0707/1556.html